基于質(zhì)譜的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)仍然面臨著一些重大挑戰(zhàn)，包括血漿蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性和寬廣的動(dòng)態(tài)范圍。因此，需要先進(jìn)的樣本制備技術(shù)來富集低豐度蛋白質(zhì)，然而手動(dòng)處理大隊(duì)列樣本需要大量的動(dòng)手時(shí)間，不僅會(huì)降低研究速度，還會(huì)有人為錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)。自動(dòng)化技術(shù)可以解決這些難題，確保大量樣本的快速處理，同時(shí)提供可擴(kuò)展性和結(jié)果的可重復(fù)性。

ENRICH-iST試劑盒（PreOmics）工作流程為高通量和深入的血漿蛋白質(zhì)組分析提供了標(biāo)準(zhǔn)化的簡(jiǎn)化的解決方案，通過將低豐度蛋白質(zhì)富集到順性磁珠上，有效打破了動(dòng)態(tài)范圍的限制，同時(shí)保留了有價(jià)值的生物信息。富集后的蛋白質(zhì)使用iST工作流程步驟進(jìn)行酶解和純化，以進(jìn)行MS分析。

為了進(jìn)一步提高血漿樣本制備工作流程的效率，將此試劑盒與TECANFluent液體工作站相結(jié)合實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)化（見圖1），其中，F(xiàn)luent工作平臺(tái)可實(shí)現(xiàn)蛋白富集，蛋白酶解，純化，肽段濃縮干燥、重懸等一系列的工作流程（見圖2），極大限度提高了前處理效率，96個(gè)血漿樣本到干燥的多肽在6h內(nèi)即可完成。為了評(píng)估此平臺(tái)的可靠性和穩(wěn)健性，本文對(duì)多日的自動(dòng)化工作流程進(jìn)行了嚴(yán)格的評(píng)估，并在一項(xiàng)研究中對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步的測(cè)試，考察了兩個(gè)年齡組之間與年齡相關(guān)的血漿蛋白質(zhì)組差異。

結(jié)果分析

多日分析旨在確定日內(nèi)和日間可重復(fù)性，以評(píng)估ENRICH-iST自動(dòng)化方案的穩(wěn)健性。在連續(xù)三天的3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，對(duì)來自單一供體的血漿進(jìn)行處理，每次實(shí)驗(yàn)均采用相同的板布局。三天血漿樣本的TIC疊加圖顯示樣本制備都是干凈的，無論哪天的色譜分離結(jié)果都具有可重復(fù)性。此外，血漿樣本、相鄰空白樣本和LC-LOAD緩沖液對(duì)照之間的總蛋白豐度比較證實(shí)，在自動(dòng)化處理過程中不存在交叉污染。

在三次實(shí)驗(yàn)中，前體和蛋白質(zhì)組的數(shù)量分別超過了12000個(gè)和1100個(gè)，比較其鑒定出的蛋白質(zhì)種類時(shí)，結(jié)果顯示有96%的重疊，表明血漿蛋白質(zhì)組的覆蓋范圍很深，且有可重復(fù)性。

為了進(jìn)一步評(píng)估定量精確度，計(jì)算了蛋白質(zhì)豐度的變異系數(shù)，并與作為參考的混合血漿樣本進(jìn)行了比較。對(duì)混合血漿多肽樣本連續(xù)進(jìn)樣五次并分析，得出LC-MS儀器的變異系數(shù)中位數(shù)為10%CV。對(duì)單個(gè)血漿樣本進(jìn)行日內(nèi)分析發(fā)現(xiàn)，三次實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)中位數(shù)分別為15%、14%、16%。這表明樣本處理過程中涉及的因素對(duì)總體變異系數(shù)中位數(shù)影響很小。此外，日間比較顯示所有實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)中位數(shù)為16%，更加表明此自動(dòng)化工作流程對(duì)血漿分析的定量非常可靠。

最后，對(duì)兩個(gè)健康年齡組的年齡依賴性血漿蛋白質(zhì)組進(jìn)行了差異分析，在六個(gè)個(gè)體中，鑒定出的蛋白質(zhì)組平均數(shù)量（約1700個(gè)蛋白質(zhì)組）非常一致，進(jìn)一步證明ENRICH-iST自動(dòng)化工作流程的穩(wěn)健性。差異分析顯示年輕或年長(zhǎng)供體中存在差異調(diào)控的多個(gè)蛋白質(zhì)。據(jù)報(bào)道，差異調(diào)控的蛋白質(zhì)中有8種是受年齡調(diào)控的（紅色標(biāo)記），其中包括GDF15（一種已確立的衰老生物標(biāo)志物）和熱門的CHI3L1（已被證明會(huì)隨著年齡而升高）。

結(jié)論

Fluent自動(dòng)化液體工作站可成功實(shí)現(xiàn)ENRICH-iST樣本制備技術(shù)自動(dòng)化流程，極大限度的減少了人工操作的步驟，整個(gè)流程僅需6小時(shí)，可在一個(gè)工作日內(nèi)輕松制備96份樣本。此自動(dòng)化工作流程為具有挑戰(zhàn)性的血漿蛋白質(zhì)組制備領(lǐng)域提供了一種實(shí)用的簡(jiǎn)化的解決方案，使研究者可以深入了解分子機(jī)制，并在小型和大型隊(duì)列研究中發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物。